Em formação

O que é passagem sequencial?


Eu li um diário que descreve passagens sequenciais com o objetivo de medir o desenvolvimento de resistência em bactérias. Gostaria de saber mais sobre como funciona o método, ou seja. o que significa "passagem"?

https://www.nature.com/nature/journal/v517/n7535/pdf/nature14098.pdf, parte Métodos, em estudos de resistência


Normalmente reluto em citar artigos da Wikipedia, no entanto, aquele para a passagem sequencial ou serial explica muito bem.

Resumidamente:

Em microbiologia, a passagem sequencial ou serial se refere ao processo de crescimento de bactérias ou vírus em iterações. Em essência, isso significa que um vírus ou cepa de bactéria será isolado e crescerá por um período de tempo. Depois que a amostra crescer por algum tempo, parte dela será transferida para um novo ambiente e poderá crescer pelo mesmo período de tempo. Este processo será repetido quantas vezes desejar. O produto final é estudado, muitas vezes em comparação com o vírus ou cepa bacteriana original para ver se ele evoluiu ou se ocorreram quaisquer outras alterações.


Os alunos que recebem 5 no exame de Biologia AP I ou uma nota 7 de IB recebem crédito totalmente equivalente a BIOS 10161 + 11161 e BIOS 10162 + 11162, ou seja, a sequência do primeiro ano de Ciências Biológicas I e II com laboratórios projetados para cursos de ciências . Para os alunos que optam por não renunciar ao crédito AP ou IB, BIOS 10098 e 10099 combinados serão aceitos como pré-requisito para todos os cursos de biologia de nível superior onde BIOS 10161 e / ou BIOS 10162 são os pré-requisitos. Os alunos que pretendem se inscrever em escolas médicas ou outras escolas profissionais onde o crédito em ciências do AP não é aceito, ou onde são necessários dois semestres de biologia geral com laboratórios de nível universitário, quase que universalmente renunciam ao crédito de AP em Notre Dame e fazem as aulas para obter o grau acadêmico crédito. Nesses casos, o BIOS 10098/10099 será revertido para crédito de não graduação em sua transcrição final, quando substituído por créditos de graduação de 8,0 letras do BIOS 10161/11161 + 10162/1116201/21201 + 20202/21202 conforme determinado pelos requisitos de seus respectivos cursos.

Os alunos que recebem 5 no exame AP de Biologia ou uma nota 7 do IB recebem crédito totalmente equivalente ao BIOS 10161 + 11161 e BIOS 10162 + 11162, ou seja, a sequência do primeiro ano de Ciências Biológicas I e II com laboratórios projetados para graduados em ciências. Para os alunos que optam por não renunciar ao crédito AP ou IB, BIOS 10098 e 10099 combinados serão aceitos como pré-requisito para todos os cursos de biologia de nível superior onde BIOS 10161 e / ou BIOS 10162 são os pré-requisitos. Os alunos que pretendem se inscrever em escolas médicas ou outras escolas profissionais onde o crédito em ciências do AP não é aceito, ou onde são necessários dois semestres de biologia geral com laboratórios de nível universitário, quase que universalmente renunciam ao crédito de AP em Notre Dame e fazem as aulas para obter o grau acadêmico crédito. Nesses casos, o BIOS 10098/10099 será revertido para crédito de não graduação em sua transcrição final, quando substituído por créditos de graduação de 8,0 letras do BIOS 10161/11161 + 10162/1116201/21201 + 20202/21202 conforme determinado pelos requisitos de seus respectivos cursos. Por favor, consulte a seção impressa deste boletim (página 125) para uma declaração geral relativa aos Cursos de Pesquisa em Biologia.


Anotações de passagem de influenza: o que elas nos dizem e por que devemos ouvir

Os bancos de dados de influenza agora contêm mais de 100.000 registros de sequência em todo o mundo para as cepas de influenza A (H3N2) e A (H1N1). Embora esses dados facilitem os esforços globais de pesquisa e as práticas de desenvolvimento de vacinas, eles também representam um obstáculo para os pesquisadores por causa de suas anotações confusas e heterogêneas. Anotações de passagem pouco claras são particularmente preocupantes, dado o trabalho recente que destaca a presença e o risco de falsos sinais de adaptação introduzidos pela passagem de células de isolados virais. Com isso em mente, pretendemos fornecer um esboço conciso do motivo pelo qual os vírus são transmitidos, uma visão geral clara da nomenclatura de anotação de passagem atualmente em uso e sugestões para uma nomenclatura padronizada no futuro. Nossa esperança é que este resumo capacite pesquisadores e médicos a entender mais facilmente a história de passagem de uma amostra de vírus ao analisar sequências de influenza.

Palavras-chave: Adaptações de passagem do vírus da influenza H1N1 H3N2.

Figuras

Ensaio HI para o desenvolvimento de vacinas.…

Ensaio HI para o desenvolvimento de vacinas. (A) Visão geral do ensaio HI. Hemaglutinin em ...

Nuvem de palavras de influenza A (H3N2) ...

Anotações de sequência de nuvem de palavras de influenza A (H3N2) indicando passagem em um ou mais ...

Sequência da influenza A (H3N2) e A (H1N1) ...

Contagens de isolados de sequência de Influenza A (H3N2) e A (H1N1) em três bancos de dados, 2005–18. (A) Agregar ...


Formulários

Os dois principais objetivos da transfecção são produzir proteínas recombinantes ou, especificamente, aumentar ou inibir a expressão gênica em células transfectadas. Como tal, a transfecção é uma ferramenta analítica poderosa para o estudo da função e regulação de genes ou produtos gênicos, para a produção de organismos transgênicos e como um método para terapia gênica.

Expressão genetica

A transfecção é mais comumente realizada para expressar uma proteína de interesse em células cultivadas (ou um modelo animal) através do uso de um vetor plasmídeo ou mRNA. A expressão da proteína em células eucarióticas permite que a proteína recombinante seja produzida com dobramento adequado e modificações pós-tradução necessárias para sua função. Além disso, a introdução de proteínas com marcadores prontamente detectáveis ​​e outras modificações nas células permite o estudo de sequências de promotor e intensificador ou proteína: interação de proteína.

Além disso, a transfecção pode ser usada em várias formas de bioprodução, dependendo da estratégia de transfecção. Por exemplo, a entrega de fatores de transcrição de reprogramação permite a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). A transfecção estável, por outro lado, fornece os meios para a bioprodução de várias moléculas terapêuticas.

Inibição do gene

Outro uso frequente da transfecção é na inibição da expressão de proteínas específicas por meio de RNA de interferência (RNAi). Em células de mamíferos, o RNAi ocorre por meio de RNA não codificante expresso endogenamente na forma de microRNAs (miRNAs), que são derivados de um precursor de RNA de fita dupla (dsRNA). O precursor é processado em um miRNA maduro que se torna parte de um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que atua inibindo a tradução de mRNAs alvo complementares.

Os sistemas baseados em vetores expressam precursores de miRNA ou precursores de RNA em gancho curto (shRNA) que são processados ​​por maquinaria endógena para produzir miRNAs ou shRNAs, respectivamente, que então atuam para inibir a expressão gênica. Estes sistemas permitem a transfecção estável de construções recombinantes e podem permitir a expressão indutível de moléculas precursoras.

Os RNAs de interferência curtos / pequenos sintetizados quimicamente (siRNAs) também podem ser incorporados em um RISC e induzir o silenciamento do gene ao direcionar o mRNA complementar para degradação. As modificações nos siRNAs ajudam a prevenir efeitos fora do alvo e também a garantir que a fita ativa do dsRNA seja carregada no RISC.


4. Discussão

Descobrimos que a passagem em série do vírus da gripe introduz um sinal mensurável de adaptação na análise evolutiva das sequências naturais do vírus da gripe. Existem padrões únicos e característicos de adaptação à passagem de ovo, passagem de célula de macaco e passagem de célula não SIAT1. Sequências derivadas de células de macaco mostram diferentes padrões de taxa evolutiva em toda a molécula. As sequências derivadas de células não SIAT1, em vez disso, exibem um ponto de acesso de seleção positiva em uma alça abaixo da região de ligação de ácido siálico. Este ponto de acesso foi observado anteriormente (Meyer e Wilke, 2015), mas nenhuma explicação para sua origem estava disponível. Passagens adicionais em células não SIAT1 fortalecem este artefato. Além disso, descobrimos que o vírus que passa em células SIAT1 parece acumular apenas artefatos de passagem menores. Ao longo de nossas análises, encontramos utilidade limitada na subdivisão de árvores filogenéticas em ramos internos e terminais. Enquanto os sinais de adaptação de passagem são consistentemente elevados ao longo dos ramos terminais e atenuados ao longo dos ramos internos, as taxas de evolução ao longo dos ramos internos permanecem confundidas por artefatos de passagem. Além disso, a adaptação de passagem pode se assemelhar a mutações fixas de estação para estação ao longo dos ramos do tronco e alterar as previsões baseadas na topologia de adequação de sequência. Finalmente, podemos recuperar com precisão as regiões antigênicas de HA determinadas experimentalmente a partir da análise de taxa evolutiva, usando um conjunto de dados que consiste em apenas sequências virais não passadas.

Estudos anteriores (Bush et al., 2001 Suzuki, 2006) sugerem o uso de ramificações internas para aliviar as adaptações de passagem. No entanto, descobrimos aqui que esta estratégia é insuficiente, porque o sinal evolutivo de adaptações de passagem pode frequentemente ser detectado ao longo de ramos internos. Esse achado pode parecer contra-intuitivo, já que os nódulos internos deveriam representar exclusivamente vírus adaptados aos humanos. Sugerimos que as adaptações de passagem em ramos internos podem ser homoplasias causadas por evolução convergente se diferentes isolados clínicos convergirem para as mesmas mutações adaptativas sob passagem, então essas mutações podem ser incorretamente colocadas ao longo de ramos internos sob a reconstrução da árvore filogenética. Além disso, embora o uso de apenas ramificações internas remova algumas diferenças entre os grupos de passagem, a exclusão de sequências terminais pode obscurecer adaptações naturais recentes e, assim, obscurecer locais reais sob seleção positiva. Portanto, a análise de ramos internos não é apenas insuficiente para eliminar artefatos de adaptações de passagem, mas também subótima para detectar seleção positiva no vírus influenza H3N2 sazonal.

A rota mais segura para evitar artefatos de passagem é limitar os conjuntos de dados de sequência apenas a vírus não passados, embora essa abordagem limite os números de sequência. Os ácidos siálicos ligados a 6 semelhantes aos humanos em SIAT1 (Matrosovich et al., 2003) reduzem grandemente as adaptações específicas de cultura de células observadas, particularmente na alça de HA que contém o local 224. Esta falta de seleção está de acordo com vários experimentos encontrando baixos níveis de adaptação nesta linha celular (Oh et al., 2008 Hamamoto et al., 2013). Como nossa análise detecta apenas pequenas diferenças entre o vírus não passado e o vírus com passagem SIAT1, postulamos que esta condição de passagem é um substituto aceitável para amostras clínicas não passadas. Mesmo assim, nossos achados não excluem a existência de adaptações específicas do SIAT1 que podem confundir análises específicas.

Mais da metade das sequências de HA passadas no banco de dados GISAID de 2005 a 2015 foram passadas mais de uma vez. Múltiplas passagens em células não SIAT1 causam acúmulo crescente de artefatos de passagem, e seria de se esperar que quaisquer efeitos de passagem ainda desconhecidos pudessem se acumular de forma semelhante. No entanto, mesmo uma única passagem em células não SIAT1 introduz artefatos de adaptação perceptíveis. O vírus da gripe costuma ser passado várias vezes para melhorar os títulos virais para os ensaios de inibição da hemaglutinação e, portanto, esperamos que os vírus com várias passagens continuem a ser depositados em um futuro previsível. Recomendamos que tais vírus sejam usados ​​com cuidado ao estudar a dinâmica evolutiva das cepas de vírus da gripe que circulam na população humana.

Embora a maioria das sequências do ano de 2015 sejam passadas ou não por SIAT1, várias centenas de sequências desse ano derivam de cultura de células de macaco. O uso de cultura de células de macacos aumentou em 2014 e 2015 em comparação aos anos anteriores. Recomendamos que essas sequências recentemente coletadas sejam excluídas da análise da taxa evolutiva do vírus influenza, em favor da maioria das sequências não passadas e das sequências SIAT1. Como a passagem é um método útil e de baixo custo para a amplificação de vírus coletados clinicamente, é improvável que as sequências virais não passadas dominem completamente os bancos de dados de sequência do vírus da influenza em um futuro próximo. No entanto, novos sistemas de cultura de células epiteliais humanas para a passagem do vírus da gripe (Ilyushina et al., 2012) podem em breve fornecer um sistema ideal que amplifica o vírus e o protege de pressões seletivas não humanas.

A história de passagem deve ser rotineiramente considerada como uma variável de confusão potencial em análises futuras das taxas de evolução do vírus influenza. Estudos futuros devem ser verificados em relação a amostras não passadas para garantir que as conclusões não sejam baseadas na adaptação a hospedeiros não humanos. Recomendamos a exclusão de sequências virais que derivam da passagem em série em amniotas de ovo, cultura de células de rim de macaco e qualquer cultura de células não especificadas. Trabalhos anteriores que não consideraram a história de passagem podem ser confundidos por adaptações de passagem, como ocorreu em nossa publicação anterior (Meyer e Wilke, 2015). Nesse artigo, concluímos que os locais sob seleção positiva diferem dos locais envolvidos no escape imunológico. Aqui, descobrimos que a origem desta seleção positiva é a adaptação ao hospedeiro de passagem não humano, não o escape imunológico ou a adaptação aos humanos. Em particular, sugerimos que os marcadores evolutivos do vírus influenza determinados em (Belanov et al., 2015) sejam reavaliados para garantir que esses locais não sejam artefatos de passagem viral. Da mesma forma, muitos dos estudos anteriores (Bush et al., 1999 Suzuki, 2006, 2008 Shih et al., 2007 Pan e Deem, 2011 Tusche, Steinbrück e McHardy, 2012 Meyer e Wilke, 2013, 2015) realizando sites específicos a análise evolutiva de HA provavelmente contém algumas conclusões que podem ser rastreadas até artefatos de passagem. Além disso, embora os artefatos de passagem não pareçam ser suficientemente fortes para afetar a reconstrução da estrutura do clado (Bush et al., 2000), eles têm o potencial de causar comprimentos de ramos artificialmente longos, devido a dN / dS inflação, ou ramos mal colocados, devido à evolução convergente sob passagem. Encontramos amostras compostas por não SIAT1 que parecem se comportar de maneira diferente das amostras não passadas sob a métrica LBI. Assim, os futuros modelos preditivos filogenéticos de aptidão e antigenicidade do vírus da gripe, como em (Bedford et al., 2014 Łuksza e Lässig, 2014 Neher et al., 2014), também devem ser verificados quanto à robustez aos sinais relacionados à passagem. Finalmente, embora esteja além do escopo deste trabalho investigar os efeitos da história de passagem em outros vírus, suspeitamos que artefatos derivados de passagem também podem ser um fator em suas análises filogenéticas. O uso de conjuntos de dados sem adaptações de passagem provavelmente trará previsões computacionais de seleção positiva para influenza mais em linha com os resultados experimentais correspondentes.

Sequências sem anotações de passagem são inadequadas para uma análise evolutiva confiável do vírus influenza. No entanto, as anotações de passagem geralmente estão ausentes das informações de deformação e, quando presentes, são freqüentemente inconsistentes; atualmente, não há uma linguagem padronizada para representar o número e o tipo de passagem em série. Notamos, no entanto, que as anotações de passagem da temporada de 2015 melhoraram muito em comparação com as temporadas anteriores. Vários dos principais repositórios de influenza, incluindo o Influenza Research Database (Squires et al., 2012) e o NCBI Influenza Virus Resource (Bao et al., 2008), não fornecem nenhuma anotação de passagem. Além disso, o histórico de passagem não é necessário para novos envios de sequência ao NCBI Genbank (Benson et al., 2012). O banco de dados EpiFlu mantido pelo GISAID (Bogner et al., 2006) e OpenFluDB (Liechti et al., 2010), no entanto, se destacam por fornecer anotações de histórico de passagem para a maioria de suas sequências. Destes, apenas o repositório OpenFluDB permite a filtragem de sequências por histórico de passagem durante o download dos dados. Nossos resultados demonstram a força dos artefatos de passagem na análise evolutiva do vírus da gripe. A falta de um padrão universal para anotação de histórias de passagem viral e um padrão universal para condições experimentais de passagem em série complicam a análise e mitigação dos efeitos de passagem.


Protocolo de técnicas de cultura de tecidos de células de mamíferos

O que se segue é uma orientação geral para a cultura de linhas celulares. Todas as culturas de células devem ser realizadas em cabine de segurança microbiológica usando técnica asséptica para garantir a esterilidade.

Conteúdo

1) Preparando um ambiente asséptico

Regulamentos do capô

Autoclavagem

  • (a) Pontas de pipeta (ou podem ser adquiridas pré-autoclavadas, sem DNAse / RNAse)
  • (b) Pipetas Pasteur de vidro de 9 "
  • (c) etanol 70% (certifique-se de pulverizar todas as áreas de superfície)

Todos os meios, suplementos e reagentes devem ser estéreis para prevenir o crescimento microbiano na cultura de células. Alguns reagentes e suplementos requerem esterilização por filtro, se não forem fornecidos estéreis.

Assista ao nosso protocolo de vídeo de técnica asséptica para obter diretrizes detalhadas sobre como evitar contaminação.

2) Preparação do meio de crescimento celular

Antes de iniciar o trabalho, verifique as informações fornecidas com a linha celular para identificar que tipo de mídia, aditivos e recomendações devem ser usados.

A maioria das linhas de células pode ser cultivada usando meio de cultura DMEM ou meio de cultura RPMI com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM e antibióticos podem ser adicionados se necessário (ver tabela abaixo).

Verifique quais meios de cultura e suplementos de cultura a linha celular que você está usando requer antes de iniciar as culturas. Os meios de cultura e suplementos devem ser estéreis. Compre reagentes estéreis quando possível, use apenas em condições assépticas em uma capela de cultura para garantir que eles permaneçam estéreis.

Exemplo geral usando mídia DMEM

meios de comunicaçãoMedir
DMEM - Retire 50 ml do frasco de 500 ml e adicione os outros constituintes. 450 ml
10% FBS50 ml
Glutamina 2 mM5 ml
100 U de penicilina / 0,1 mg / ml estreptomicina5 ml

3) Criação do ambiente de cultivo correto

A maioria das linhas celulares crescerá em frascos de cultura sem a necessidade de matrizes especiais, etc. No entanto, algumas células, particularmente as células primárias, exigirão crescimento em matrizes especiais, como colágeno, para promover a fixação, diferenciação ou crescimento celular. Recomendamos revisar a literatura relevante para obter mais informações sobre as células que você está cultivando.

O seguinte é um exemplo para células endoteliais e epiteliais:

Para células humanas, cubra os frascos com 1% de gelatina. Alternativamente, para outros tipos de células, como BAEC, os frascos podem ser revestidos com fibronectina a 1%.

  1. Preparar 10mL de solução de revestimento composta por 1% de gelatina ou 1% de fibronectina diluindo com água destilada, seguida de filtração. Isso é eficiente para revestir cerca de 5 frascos.
  2. Pipete a solução de revestimento para o frasco. Balance para a frente e para trás para distribuir uniformemente o fundo do frasco. Deixe descansar em uma incubadora por 15-30 minutos.
  3. Aspire a solução de revestimento e lave com dH estéril2O antes de ver as células.

4) Verificando células

As células devem ser verificadas microscopicamente diariamente para monitorar a saúde, as taxas de crescimento e a confluência (% da área de superfície coberta com monocamada de células).

As células aderentes devem ser fixadas principalmente ao fundo do frasco, mostrar uma morfologia aderente (dependente da linha celular) e refratar a luz ao redor de sua membrana (consulte as imagens da planilha de dados da linha celular Abcam).

As células em suspensão devem apresentar uma morfologia circular e refratar a luz ao redor de sua membrana. Algumas células em suspensão podem se aglomerar (reagentes de dissociação, como Pluronic PF68, podem ser adicionados para promover a remoção do aglomerado).

A mídia que inclui o vermelho de fenol deve ser rosa / laranja (a cor da mídia pode mudar dependendo do CO2 ambiente). Para aplicação de imagem, mídia sem vermelho de fenol pode ser usada e evitará interferência na aquisição de imagem. Uma cor amarela pálida do meio indicaria uma acidez e diminuição do pH, que geralmente está associada a contaminação ou células prejudiciais à saúde.

  • Eles estão se destacando em grande número (linhas fixas) e / ou parecem enrugados e granulados / escuros na cor.
  • Eles estão em repouso (não parecem estar crescendo).

5) Subcultura

Também conhecido como divisão celular e passagem de células.

Proporções de divisão ou densidades de semeadura podem ser usadas para garantir que as células estejam prontas para um experimento em um determinado dia ou manter culturas de células para uso futuro ou como reserva. As linhas de células em suspensão são semeadas com base no volume, de modo que as densidades de semeadura serão calculadas como células / mL, enquanto as linhas de células aderentes são semeadas com base na área de superfície do frasco, portanto, serão calculadas como células / cm 2. As linhas de células geralmente requerem densidades de semeadura específicas, portanto, sempre verifique as orientações para a linha de células em uso. As células de crescimento lento podem não crescer se uma alta proporção de divisão for usada. As células de crescimento rápido podem exigir uma alta proporção de divisão para garantir que não cresçam demais.

As linhas celulares aderentes podem ser divididas usando razões de divisão específicas da linha celular ou densidades de semeadura (células / cm 2):

  • A divisão 1: 2 deve ser 70-80% confluente e pronta para um experimento em 1 a 2 dias
  • A divisão 1: 5 deve ser 70-80% confluente e pronta para um experimento em 2 a 4 dias
  • A divisão 1:10 deve ser 70-80% confluente e pronta para subcultura ou plaqueamento em 4 a 6 dias.

Razões de divisão são baseadas na área de superfície do frasco, por exemplo:

Frasco de 1 x 25 cm 2 Divisão 1: 3 renderia frascos de 3 x 25 cm 2 ou 1 x 75 cm 2

As linhas de células em suspensão devem ser mantidas usando densidades de semeadura específicas da linha de células (células / mL):

  • 2e5 deve estar pronto para um experimento em 3-4 dias
  • 1e6 deve estar pronto para um experimento em 1-2 dias

Se as células forem deixadas sem supervisão por períodos mais longos (ou seja, fins de semana de feriados bancários), é recomendado usar uma densidade de semeadura / proporção de divisão mais baixa do que o normal.

​6) Protocolo de subcultura aderente (usando reagente de dissociação)

Quando as células estão aproximadamente 80% confluentes (80% da superfície do frasco é coberta por monocamada de células), as células ainda devem estar em sua fase logarítmica de crescimento e exigirão subcultura. Não é recomendado permitir que as células se tornem excessivamente confluentes, pois isso pode afetar negativamente a expressão gênica e a viabilidade celular.

  1. Remova o meio de cultura de células e o reagente de dissociação da geladeira e coloque em uma incubadora a 37 o C e deixe aquecer a 37 o C.
    - Não deixe a mídia na incubadora por mais tempo do que o necessário, pois os componentes da mídia se degradarão com o tempo.
  2. Ligue e execute uma limpeza básica para seu armário de segurança biológica.
    - Pulverize todos os frascos de mídia, pipetas e tubos de centrífuga com etanol antes de colocá-los no gabinete de segurança biológica.
  3. Sob o gabinete de segurança biológica, remova o meio condicionado e lave suavemente a monocamada de células com DPBS à temperatura ambiente.
    - Adicione cuidadosamente DPBS ao lado do frasco para não desalojar à força as células aderentes.
  4. Remova o DPBS usando uma pipeta sorológica estéril e adicione o reagente de dissociação pré-aquecido (Tripsina-EDTA) ao frasco e coloque em uma incubadora por

7) Subcultura de linhas celulares frouxamente anexadas que requerem raspagem de células para subcultura

  1. Quando estiver pronto, despeje cuidadosamente a mídia do frasco das células necessárias para o recipiente de resíduos (contendo aproximadamente 100 ml de hipoclorito de sódio a 10%), tomando cuidado para não aumentar o risco de contaminação com qualquer gotejamento.
  2. Substitua imediatamente despejando cuidadosamente um volume igual de meio de cultura fresco pré-aquecido no frasco.
  3. Usando o raspador de células, raspe suavemente as células do fundo do frasco para a mídia. Verifique se todas as células saíram inspecionando a base do frasco antes de prosseguir.
  4. Retire a quantidade necessária de suspensão de células para a proporção de divisão necessária usando uma pipeta sorológica.
    por exemplo. para divisão de 1: 2 de 100 ml, coloque 50 ml em um novo frasco
    1: 5 dividido a partir de 100 ml, coloque 20 ml em um novo frasco
    1:10 divisão de 100 ml, coloque 10 ml em um novo frasco
  5. Complete os novos frascos até o volume necessário (levando em consideração a proporção de divisão) com meios de cultura frescos pré-aquecidos
    por exemplo. em frasco de 25 cm 2 aproximadamente 5-10 ml
    Frasco de 75 cm 2 de aproximadamente 10-30 ml
    Frasco de 175 cm 2 de aproximadamente 40-150 ml

8) Subcultura de linhas celulares anexadas que requerem tripsina

Observação - nem todas as células exigirão tripsinização e, para algumas células, pode ser tóxico. Também pode induzir internalização temporária de algumas proteínas de membrana, o que deve ser levado em consideração ao planejar experimentos. Outros métodos, como a raspagem suave das células ou o uso de um detergente muito suave, podem ser usados ​​como um substituto nessas circunstâncias.

  1. Quando estiver pronto, despeje cuidadosamente a mídia do frasco das células necessárias para o recipiente de resíduos (contendo aproximadamente 100 ml de hipoclorito de sódio a 10%), tomando cuidado para não aumentar o risco de contaminação com gotejamentos.
  2. Usando uma técnica asséptica, despeje / pipete PBS estéril suficiente no frasco para lavar as células e se livrar de qualquer FBS no meio de cultura residual. Incline o frasco suavemente algumas vezes para enxaguar as células e despeje / pipete com cuidado o PBS de volta para o recipiente de resíduos.

Isso pode ser repetido mais uma ou duas vezes, se necessário (algumas linhas de células levam muito tempo para tripsinizar e precisarão de mais lavagens para se livrar de qualquer FBS residual para ajudar a tripsinização)

9) Subcultura de linhas de células em suspensão

  1. Verifique as diretrizes para a linha de células quanto à proporção de divisão recomendada ou densidades de células de subcultura.
  2. Retire a quantidade necessária de suspensão de células do frasco usando uma pipeta e coloque em um novo frasco.
    Por exemplo, para divisão 1: 2 de 100 ml de suspensão de células, retire 50 ml
    Para divisão de 1: 5 de 100 ml de suspensão de células, retire 20 ml
  3. Adicione a quantidade necessária de meios de cultura de células pré-aquecidos em um frasco novo.
    por exemplo. Para divisão 1: 2 de 100 ml, adicione 50 ml de meio fresco a 50 ml de suspensão de células
    Para divisão de 1: 5 de 100 ml, adicione 80 ml de meio fresco a 20 ml de suspensão de células

10) Mudança de mídia

Se as células estiverem crescendo bem por alguns dias, mas ainda não estiverem confluentes, elas exigirão uma troca de mídia para reabastecer os nutrientes e manter o pH correto. As células produzem fatores de promoção de crescimento positivos que são secretados em seus meios de comunicação, portanto, pode ser benéfico realizar uma meia mudança de meio para reabastecer os nutrientes fornecidos pelos meios de comunicação e também manter esses fatores de crescimento positivos.

Para mudar o meio, aqueça o meio de cultura a 37 ° C em banho-maria ou incubadora por pelo menos 30 min. Aspire a mídia velha do frasco e substitua a mídia com o volume necessário de meio de cultura pré-aquecido fresco e retorne à incubadora.

11) Número da passagem

O número da passagem é o número de subculturas pelas quais as células passaram. O número da passagem deve ser registrado e não ficar muito alto. Isso evita o uso de células que sofrem deriva genética e outras variações.


Qual é o seu número de passagem?

A boa prática celular requer o início de qualquer experimento com cultura de células de passagem baixa e limite o número de passagens que você aceitará em seu experimento. Mas o que é um bom número de passagem (além de “zero”, isto é)? Os números diferiram ao longo dos anos. Alguns padrões recomendam três subculturas de estoque e três subculturas de “cultura de trabalho” - essas subculturas somam sete passagens, incluindo a passagem original da referência. Enquanto isso, alguns produtores de cultura de células cobram mais por culturas de duas passagens ou menos. No entanto, a ATCC alerta os pesquisadores para supor que uma cultura de células de uma fonte comercial pode estar a uma ou duas passagens de distância da cepa de referência. Geralmente, a ATCC recomenda que a cultura de células seja limitada a cinco passagens, pelo menos para uso em aplicações médicas e biofarmacêuticas.


O que é passagem sequencial? - Biologia

Instruções para executar a análise

  • Python 2.7
  • Pandas (aqui, 0,13)
  • BioPython (aqui, 1,66)
  • FastTree 2.18 ou superior compilado para ramificações curtas (veja abaixo)
  • HyPhy (Aqui, 2.26) http://hyphy.org/
  • R 3.2.1 ou superior
  • FigTree ou outro software de visualização de árvore
  • ete3

Primeiro, remova todos os arquivos .tree em / trees /, arquivos .txt em input_fasta_summary e arquivos .dat em / rate_measurement_data / e arquivos .corr .raw .png e .csv em data_analysis

Download inicial de dados e formatação FASTA

1. Download de dados e etapas de configuração

  • git clone project no diretório home do linux
  • Crie uma conta GISAID (http://platform.gisaid.org/epi3/frontend)
  • Na guia http://platform.gisaid.org/epi3/frontend - & gt EpiFlu, selecione as sequências com os seguintes parâmetros Type = UMA, H = 3, N =2, Host = Humano, Localização = América do Norte, Segmentos necessários = HA, apenas completo
  • Na página de arquivos lançados, selecione todos e clique em Download
  • Na página de opções de download, baixe com os seguintes parâmetros: Format = Sequências (nucleotídeos) como FASTA, Proteínas = HA, Cabeçalho FASTA = Isole o nome, detalhes / história da passagem, Formato de data = AAAA-MD-DD, substitua os espaços por sublinhados no cabeçalho FASTA - & gt clique em download
  • Baixe também a tabela de reconhecimentos GISAID
  • Com sequências suficientes, a tabela de confirmações GISAID pode não ser capaz de baixar tudo de uma vez. Pode ser necessário dividir o download em vários períodos de tempo
  • Coloque o arquivo fasta GISAID bruto no / input_data pasta

uma. Compile FastTree para ramais curtos adequados para dados de influenza

  • FastTree padrão não permite comprimentos de ramificação menores que 0,0005
  • FastTree deve ser a versão 2.1.7 ou superior, compilado com a seguinte linha para permitir o tipo de ramos curtos nas árvores da gripe:
  • Baixe FastTree.c (http://meta.microbesonline.org/fasttree/FastTree.c)
  • Corre:

3. Limpe os fastos iniciais do comprimento do ramo longo e sequências anormais

  • No / run_analysis run: $ bash step1_format_fasta.bash ../input_data/[name_of_downloaded_gisaid.fasta]
  • Isso produzirá formatted.tree na pasta de nível superior / trees.

4. Inspeção manual da árvore filogenética e remoção de clados anormais

  • Freqüentemente, os dados de influenza baixados contêm sequências anômalas que introduzem comprimentos de ramos longos
  • Abra formatted.tree (armazenado em / trees / formatting_trees) usando um programa de visualização de árvore como o FigTree
  • Copie qualquer clado de branch longo (mais de 0,01 de comprimento) em um novo arquivo e chame-o de ab.txt (pode estar ainda na string de formato newick).
  • Os IDs FASTA serão analisados ​​em ab.txt e removidos do resto da análise
  • Coloque ab.txt no nível superior / input_data pasta

5. Divida FASTA por história de passagem e ano

  • No / run_analysis executar: $ bash step2_divide_passage_and_year.bash
  • Gera arquivos FASTA divididos por ano e histórico de passagem para / fastas / passage_and_year_divided_fastas /
  • Gera arquivos FASTA divididos apenas pelo histórico de passagem para / fastas / passage_divided_fastas /
  • Este script bash chama remove_sequences.py, align_and_translate.py, passageparser.py, timeseries.py, timesort.py, getpassage.py, getidentifiers.py e get_unique_records.py.
  • remove_sequences.py remove todos os clados anormais criados na etapa anterior
  • passageparser.py divide FASTA pelo histórico de passagem
  • timesort.py divide a saída de passageparser.py por ano, de 2005 a 2015, e cria um grupo externo de sequências de 1968 a 1977
  • timesort.py também faz uma série de arquivos de resumo de IDs de passagem, IDs FASTA e contagens por ano, que são armazenados em / input_fasta_summary
  • timeseries.py cria timeseries_all.txt e timeseries_yearly, que contêm contagens de sequências divididas por tipo de passagem para todos os anos e cada ano, respectivamente
  • getpassage.py cria passageIDs_all.txt e passageIDs_yearly, que listam todos os IDs de passagem classificados por seu tipo de passagem definido para todos os anos e cada ano, respectivamente. Útil para garantir que o histórico de passagens está sendo analisado corretamente
  • getidentifiers.py cria identifiers_all.txt e identifiers_yearly.txt, que listam todos os IDs de registro classificados por tipo de passagem para todos os anos ou cada ano, respectivamente.
  • align_and_translate.py translates and align sequences. Outputs to /fastas/formatting_fastas/. Viewing the protein alignment is useful as a check for gap introducing sequences, which should be removed from this analysis

##Evolutionary rate reconstructions

In this section, evolutionary rates (dN/dS) are reconstructed from selections of subdivided FASTA files created from step2_divide_passage_and_year.bash

Parameters for each condition are stored in bash scripts in /condition_parameters with matching names. A new condition can be made in /condition_parameters/ using the format parameters_[condition_name].sh. Each new [condition_name] must be added to run_analysis/step3_sort_conditions.bash and step4_analyze_conditions.bash

Reconstruct dN/dS for sample sizes matched to the number of sequences in the passage type with fewest sequences between 2005 and 2015. Sample size limiter = egg culture (79 sequences) Folders or files with names including "eggmatched20052015" contain data associated with this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, non-SIAT1 cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, generic cell culture, and a pooled group of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = MDCK-SIAT1 cell culture (1046 sequences) Folders or files with names including "siatmatched20052015" contain data associated this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, monkey cell culture, non-SIAT1 cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, generic cell culture, and a pooled group of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = monkey cell culture (917 sequences) Folders or files with names including "monkeymatched20052015" contain data associated this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, non-SIAT1 cell culture, gneric cell culture, and a pooled groups of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = unpassaged (1703 sequences) Folders or files with names including "unpassagedmatched20052015" contain data associated this condition Sample size limiter = unpassaged

Reconstruct dN/dS for size matched samples of non-SIAT1 MDCK cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, unpassaged sequences from 2014. Sample size limiter = unpassaged (249 sequences) Folders with names including "unpassagedmatched2014" contain data associated with this condition

(Not used in paper) Reconstruct dN/dS for all sequences available for all passage types from 2005-2015 unpassagedmatched2014 Folders or fileswith names including "allsequences20052015" contain data associated with this condition

6. Sort fastas divided by year and passage history into experimental groups. Also, take random samples for matched conditions

  • No run_analysis/ $ bash step3_sort_conditions.bash
  • This script calls sort_conditions.sh for each condition, and sorts/randomly samples FASTAs according to parameters stored in /condition_parameters/
  • Requires script randomdraw.py
  • For each FASTA in a condition's experimental set, this step uses FastTree to reconstruct a phylogenetic tree
  • There is a choice whether to manually reroot trees (manual) or trim down an existing full tree (auto)
  • Modify command in step3_sort_conditions.bash to ex. bash bash sort_conditions.sh unpassagedmatched2014 samp manual

7 (Optional): Manually format trees

  • For each tree in /trees/allpassages_trees/, trees/matched_allpassages_trees, /trees/matched_nonsiatunpassaged_trees, and trees/matched_siatnonsiat_trees:
  • Open tree in FigTree (or other tree visualization software)
  • Select the outgroup branch of sequences from 1968-1977, and click Reroot (ctrl + r)
  • Sort branches ascending (ctrl + u)
  • Select the non outgroup branch and copy (ctrl + c)
  • Open new FigTree window (ctrl + n)
  • Paste in non-outgroup branch (ctrl + v)
  • For an original tree named outgroup_X_N_20052014.tree, save the new non-outgroup containing tree in the same folder with the prefix samp_ or complete_ depending on if it derives from a random sample or not. Only trees from the allpassages condition should be named complete_. Trees from matched conditions should be named samp_. Ex.outgroup_samp_siat_229a_2014.tree (unrooted tree with outgroup)-> samp_siat_229a_2014.tree (rooted tree without outgroup)

No /run_analysis run: $ bash step4_analyze_conditions.bash This script calls start_SLAC for each condition, which formats tree files for SLAC analysis, starts SLACrun.sh, sorts output data files to rate_measurement_data, and calls consolidate.py to compile output dN lists to slac_output.csv in /data_analysis/

  • Requires SLACrun.sh, and consolidate.py
  • It is important that .tree and .fasta base filenames match exactly, ie. complete_pooled_all_20052014.tree and complete_pooled_all_20052014.fasta
  • The formatting step creates a temporary tree files with removed spaces, extra text, pipes (|), apostrophes, and tabs, which cause errors in the HyPhy SLAC analysis.
  • slac_output.csv is the input data file for figures and statistical analysis

9. Map dN/dS onto structure

First, run stats_and_figs.Rmd to generate correlations between dN and moveable inverse distance as well as a file of sitewise dN/dS (see paper for description).

This script will generate:

nonsiat_inverse_dnds.corr -> Data for Figure 5A

unpassaged_inverse_dnds.corr -> Data for Figure 5B, 6A

unpassaged_dnds.raw -> Data for Figure 6B

Ensure files are saved in /data_analysis directory

In pymol GUI command line, navigate to /data_analysis

Modify input filename in color_script.py

In the pymol GUI command line, input "run color_script.py"

This will open 2YP7clean.pdb

In the pymol GUI command line, input "import spectrumany"

In the pymol GUI command line, input "spectrumany b, white red, [structure name], [minvalue], [maxvalue]"

Save image, and repeat for each .corr or .raw file

Extra instructions to generate a new structure_map.txt and distances.dat for a different influenza structure. Files structure_map.txt and distances.dat for pdb:2YP7 are already provided in /data_analysis.

For more details see Meyer and Wilke, 2015 scripts and files for this analysis are in structure_mapping/

  • Download the H3N2 2YP7.pdb or other file from the Protein Data Bank
  • Open in Pymol GUI
  • Click S at the lower right
  • Then Display -> Sequence mode -> Chains
  • Then click to highlight all chains after B, and right click delete
  • Then Display -> Sequence mode -> Residues codes, and delete until first aa is position 10.
  • Make sure each alpha carbon CA corresponds to one amino acid, ie. consolidate CA1 and CA2 lines to one CA
  • Check to make sure the end is around 570 aa
  • Run python /scripts/translate_align_mapping.py /fastas/formatting_fastas/protein.fasta [structure_name].pdb *This generates structure_map.txt *protein.fasta was generated from the formatted input FASTA by /scripts/align_and_translate.py called in step2_divide_passage_and_year.bash
  • See how many lines the structure_map.text is
  • See how long any sequence in protein.fasta is
  • Delete -'s from end of structure_map.txt until they match the length of a protein in protein.fasta (ex. 577 lines)
  • Run /scripts/distances.py [clean structure name] to generate distances.dat for data analysis

After running step2_divide_passage_and_year.bash to remove any clades that stick out as long branch, manually check the output outgroup_pooled_all_20052014.tree first for any long branch clades remaining in the dataset. If any are found, add them to ab.txt, and rerun starting from step2_divide_passage_and_year.bash

Random sample size can be modified in any sort_matched_type.sh script by placed the desired sample size as the first argument to python randomdraw.py, prior to the list of input files

The regex for dividing sequences by passage type in passageparser.py is checked only for accuracy only for passage annotations in the dataset used for this project. Passage sorting of any new dataset should be manually checked for accuracy. Useful files for checking passage sorting are created by step2_divide_passage_and_year.bash, and stored in input_fasta_summaries/. Check unsortable.txt for sequences that can't be separated by year. Check passageIDs_all.txt to make sure passage annotations match categories, i.e. egg or generic cell.

/data_analysis scripts for making paper figures, as well as raw data used by these scripts

  • stats_and_figs_influenza_passaging.Rmd - R markdown script for making figures. Open in R studio, and set current working directory to /data_analysis and run
  • slac_output.csv - dN data generated from SLAC analysis
  • color_script.py - Run from pymol command line. Colors amino acids in a pymol structure by assigned values.
  • H3N2clean.pdb - modified structure from PDB:2YP7. Used as structure in figures
  • distances.dat - Each line contains distance measurements between a reference amino acid and every other amino acid in Renumbered_Structure.pdb
  • structure_map.txt - Guides the alignment of an input FASTA alignment and a pdb structure for generating correlations between sitewise dNs and amino acids in a structure
  • spectrumany.py - script imported by color_script.py for custom structure coloring

/run_analysis: Starting point for running analysis on an input fasta of Influenza hemagglutinin sequences annotated with passage information (available from gisaid.org). Pulls scripts from /scripts. Stores output data in /rate_measurement_data, and creates summary of evolutionary rates, slac_output.csv, stored in /data_analysis

  • step1_format_fasta.bash - Requires filename of influenza sequences with passaging information as an argument. Input FASTA headers must have format >[passage_abbreviation]_|_[strain_ID]
  • step2_divide_passage_and_year.bash - Requires output of step 1, and manually confirmed phylogenetic trees. Divides sequences from the formatted FASTA by passage history and year
  • step3_sort_conditions.sh - Compiles FASTAs for each experimental condition in /condition_parameters and builds phylogenetic trees of each sample group
  • step4_analyze_conditions - Starts the HyPhy SLAC analysis for each sample group

/input_data: Folder where user places input data for analysis

  • Holds input FASTA from GISAID, as well as user created ab.txt file of abnormal clade identifiers from manual tree trimming after step 1

/input_fasta_summary: Folder stores summary data of sequences in the starting FASTA file

  • This folder will contain counts of sequences divided by passage history and year created during run_step2.sh
  • timeseries_all.txt - counts of sequences from each passage type
  • timeseries_yearly.txt - counts of sequences from each passage type by year
  • identifiers_all.txt - all FASTA headers divided by passage type
  • identifiers_yearly.txt - all FASTA headers divided by passage type and year
  • passageIDs_all.txt - all nonredundant passage identifiers - useful to check that passage history sorting from passageparser.py is correct

/trees: Storage of phylogenetic trees constructed by FastTree 2.0

  • /formatting_trees - Trees used in course of formatting input FASTA. Will hold formatted.tree (the tree created during step 1)
  • /allpassages_trees - see above or /condition_parameters abaixo
  • /matched_allpassages_trees- see above or /condition_parameters abaixo
  • /matched_nonsiatunpassaged_trees - see above or /condition_parameters abaixo
  • /matched_siatnonsiat_trees - see above or /condition_parameters abaixo

/fastas: Storage of all FASTAs

  • /formatting_fastas - FASTAs created in course of formatting input FASTA, including outgroup.fasta, trimmed.fasta, unsortable.fasta, unusedyears.fasta, protein.fasta, nucleotide.fasta, and abnormal_clade.fasta
  • /passage_divided_fastas - naming format allyears_X.fasta
  • /passage_and_year_divided_fasta - naming format div_X.fasta
  • /tenyear_passage_divided_fastas - naming format complete_X.fasta
  • /allsequences20052015_fastas - see above or /condition_parameters abaixo
  • /eggmatched20052015_fastas - see above or /condition_parameters abaixo
  • /monkeymatched20052015_fastas - see above or /condition_parametersabaixo
  • /siatmatched20052015_fastas- see above or /condition_parameters abaixo
  • /unpassagedmatched20052015_fastas - see above or /condition_parametersabaixo
  • /unpassaged2014_fastas- see above or /condition_parameters abaixo

/rate_measurement_data: Storage of all SLAC analysis evolutionary rate outputs

  • Naming convention of files is [complete/samp][passage_type][Number of sequences]_[year range].dat
  • complete prefix files originate from allpassaged analysis, using all available sequences from tenyear_passage_divided_fastas
  • samp prefix files originate from matched analyses, using random samples of sequences from either 2005-2015 or 2014

/SLAC: Folder holds everything necessary to run SLAC on a matching FASTA and .tree file

  • /fulltree - Conventional SLAC analysis. Models evolutionary rates from all available sequences and branches
  • /internals - Uses only internal branches of the tree to model evolutionary rates
  • /tips - Uses only tips of the tree to model evolutionary rates
  • HYPHYMP must be installed

align_and_translate.py - Takes in a file of nucleotide sequences, translates, aligns, and returns both a nucleotide and protein alignment. Outputs nucleotide.fasta, protein.fasta

get_unique_records.py - Takes in a FASTA of DNA sequences and removes duplicate

getidentifiers.py - Takes in a FASTA of sequences and lists all record IDs

getpassage.py - Takes in a FASTA of sequences with header format "PASSAGE_HISTORY_|_STRAIN_ID" and lists all passage IDs

timesort.py - Takes in a FASTA of sequences and sorts them into new FASTA files by year

lengthdetermine.py - Determines number of records in shortest of input FASTA files.

formattingparser.py - Takes in FASTA, gets ORFS, and exclude sequences with insertions or deletions, and standardizes record ID formats.

passageparser.py - Takes in FASTA of sequences, and sorts them into new FASTAs by their passage history.

processtrees.sh - Takes in Newick format .tree file and corresponding FASTA file, removes pipe character from record IDs. Starts SLACrun.sh.

SLACrun.sh - Organizes files into /SLAC folder. Starts run_dNdS.bash for fulltree, internal branches, and tips conditions. Renames and moves sites.dat file output by HYPHYMP to /rate_measurement_data.

randomdraw.py - Takes up to three random samples (without replacement) of sequences from each input FASTA file.

remove_sequences.py - This script takes a text file of identifiers-to-remove, removes them from the original FASTA, and saves a FASTA of the sequences which were removed

sort_conditions.sh X Y- For condition X, this script pulls appropriate FASTAs files, add in an outgroup, and starts FastTree. Y is either "samp" or "complete", without quotes, depending on whether a random draw is performed in the condition.

start_SLAC.sh X - For condition X, this script starts processtree.sh (SLAC analysis), and adds output to slac_output.csv

consolidate.py - Takes all dN columns from .dat SLAC output files in in rate_measurements, as well as "numbering_table.csv" from Meyer and Wilke, 2015, and combines them into slac_output.csv

run_dNdS.bash - Script to automate SLAC analysis

/condition_parameters:

parameters_allsequences.sh - Take every FASTA from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/

parameters_eggmatched20052015.sh - Take every FASTA from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_monkeymatched20052015.sh - Take monkey, cell, unpassaged, and pooled FASTAs from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_siatmatched20052015.sh - Take FASTAs from passage groups nonsiat, siat and unpassaged from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ from 2005-2015 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_unpassagedmatched20052015.sh - Take FASTAs from passage groups nonsiat and unpassaged from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ from 2005-2015 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_unpassagedmatched2014.sh - Take FASTAs from passage groups siat, nonsiat, and unpassaged from fastas/passage_and_year_divided_fastas/ from 2014 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

/structure_measurements: This folder contains scripts and datafiles for generating structural measurements. Output from this analysis is prestored in /data_analysis

  • distances.py - Creates a file of measurements from each amino acid in a protein structure to every other amino acid. Each line in the output distance.dat contains measurements from one amino acid as reference point /structure_mapping - Storage for files for structural measurements and mapping
  • translate_align_mapping.py - for aligning sites with structure. outputs structure_map.txt
  • 2YP7H3N2.pdb - Raw structure from the Protein Data Bank.
  • 2YP7clean.pdb - Modifed structure compatible for structure painting (see above)
  • structure_map.txt - for aligning sites with structure
  • distances.dat - Distances from every site in 2YP7clean to every other site

LBI (Least Branching Index)

This is an analysis using a method from Neher et al 2014, "Prediction evolution from the shape of genealogical trees" - https://elifesciences.org/content/3/e03568

The LBI_analysis directory is built off a clone of https://github.com/rneher/FitnessInference Using the scripts rank_sequences.py, and the prediction_src directory

In this analysis, sequences are ranked by their degree of branching in a reconstructeed tree. Top ranked sequences ideally predict the following years ancestral better than a randomly picked sequence.

Conditions of sequences in paper

  • 50 draws of up to 100 sequences per passage group per year
  • If 100 sequences are not available, 70% of available sequences are repeatedly drawn

Sequences for this analysiswere generated with :

  • bash scripts/sort_conditions_LBI.sh sampleSingleyears samp
  • with parameter script: condition_parameters/parameters_allsequencesSingleyears.sh

Place target FASTA in fastas/

Create an Outgroup file called "outgroup" and place in LBI_analysis/ basedir

This file should contain one outgroup sequence in FASTA format for the analysis

cat this file onto each analyis FASTA in fastas/

ex. for f in samp_* do cat outgroup $f > outgroup$ done

To run the analysis on files in the fastas:

for f in fastas/outgroup* do bash run_analysis_passages.sh $f done

Folders with results are saved in output/

ancestral_sequences.fasta : Internal nodes of ancestral tree. Sequence 1 = root

reconstructed_tree.nwk : Ancestrally reconstructed tree

sequence_ranking_terminals : Ranking of terminal sequences according to LBI algorithms. 1 is top rank

marked_up_tree.pdf : image of reconstructed tree with LBI algorithm ranking coloring

In order to consolidate outputs of LBI analysis:

For multiple random draws (analysis used in this manuscript) :

  • /fastas : Where to put input fastas
  • /output : Where output results are sent
  • prediction_src : Core scripts from Neher et al. 2015 for calculating LBI
  • /processed : output folders not currently being used
  • /scripts : Scripts to control analysis
  • /scripts/rank_sequences.py : Main control script for LBI from Neher 2014
  • /scripts/infer_fitness.py : Make predictions with fitness instead of LBI
  • /scripts/get_data_randdraws.py : After analysis is run, this scripts collects output into a table format
  • Headers of output table:
  • passage, year, category, trial, stat, num_seq : identifying information of sequence. Stat in this case is always rankseqs
  • topRankID, topRankSeq, mean stdev : The top ranked LBI sequence/ID, as well as the mean and standard deviation of LBI scores
  • ancestral_seq : The ancestral sequence of the condition
  • random_seqID, random_seq : A random sequence to compare performance of the top ranked sequence
  • hamming_to_next_self, hamming_to_next_unpassaged, hamming_to_next_pooled: hamming distance to following years ancestral_seq from different passage conditions.
  • hamming_rand_self, hamming_rand_unpassaged, hamming_rand_pooled: Likewise, but calculated with the random sequence
  • ratio_self, ratio_unpassaged, ratio_pooled : The ratio of the hamming distance from LBI choice sequence to the random sequence.

Serial passaging analysis

This analysis demonstrates that as number of passages in nonSIAT1 MDCK increase, spurious correlation strength increases

  • To run:
  • bash run_analysis/serial_analysis2.sh
  • This will select sequences from complete_nonsiat_all_20052015.fasta which are passaged once, twice, or 3-5 times.
  • then, bash scripts/start_SLAC.sh singleserial20052015 samp
  • This using the condition_parameters file /condition_parameters/singleserial20052015.sh
  • This will pull complete_unpassaged_all_20052015.fasta as the zero passage case, then take a sample size matched draw and start HYPHY SLAC to get dN/dS
  • Visualiziation included in main scripts stats_and_figs.Rmd

In this analysis, trunk sequences are pulled from a reconstructed tree.

dN/dS is calculated for trees constructed from different passage histories in order to determine if passaging signal extends to the trunk of the tree

  • Move fastas of conditions to get trunk dN/dS for into trunk_analysis/fastas
  • Get reconstructed trees and trunk sequences with:
  • bash scripts/get_trunk.sh
  • Output is placed in trunk_analysis/output
  • Calculate dN/dS (where dS=1) with:
  • bash scripts/get_dnds.sh
  • Output dN is placed in /rate_measurement_data and added to slac_output.csv
  • Analyzed in stats_and_figs.Rmd main analysis script

Take 200 random draws from the pooled condition a null to calculate likelihood of unpassaged correlation

  • bash get_random_tree.sh
  • bash scripts/start_SLAC.sh randomsamples20052015 samp
  • This using the condition_parameters file /condition_parameters/randomsamples20052015.sh
  • Visualiziation and statistics included in main scripts stats_and_figs.Rmd

Opções de acesso

Obtenha acesso completo ao diário por 1 ano

Todos os preços são preços NET.
O IVA será adicionado mais tarde no check-out.
O cálculo do imposto será finalizado durante o checkout.

Obtenha acesso limitado por tempo ou ao artigo completo no ReadCube.

Todos os preços são preços NET.


All Science Journal Classification (ASJC) codes

  • APA
  • Author
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standard
  • RIS
  • Vancouver

In: Aquaculture , Vol. 132, No. 1-2, 15.04.1995, p. 73-80.

Resultado da pesquisa: contribuição para o jornal ›Artigo› revisão por pares

T1 - The sequential changes of the virion polypeptides of CV HB1 virus (Birnaviridae) during serial undiluted passaging

N2 - Clam virus (CV HB-1) isolated from hard clam Meretrix lusoria, typed as infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) Ab serotype, was employed for the present study. The structural polypeptides of purified virus generated by serial undiluted and diluted passaging were analyzed using sodiumdodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results indicated that in VP2, the virus particles of serial undiluted passaging had viral polypeptides smaller than those of serial diluted passaging. Furthermore, a polypeptide with a molecular mass of 105 kDa was found in the serial undiluted virus preparation. Further analysis by monoclonal antibodies showed that VP105 might be a polyprotein produced by genomic RNA segment A. To investigate the sequential changes of viral polypeptides of the virus preparation at high multiplicity infection, the viral polypeptides at each undiluted passage were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting. The results indicated that VP105 was present by undiluted passage 7, while the smaller VP2 was present by undiluted passage 10. The amount of smaller VP2 and VP105 increased as the number of passages increased.

AB - Clam virus (CV HB-1) isolated from hard clam Meretrix lusoria, typed as infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) Ab serotype, was employed for the present study. The structural polypeptides of purified virus generated by serial undiluted and diluted passaging were analyzed using sodiumdodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results indicated that in VP2, the virus particles of serial undiluted passaging had viral polypeptides smaller than those of serial diluted passaging. Furthermore, a polypeptide with a molecular mass of 105 kDa was found in the serial undiluted virus preparation. Further analysis by monoclonal antibodies showed that VP105 might be a polyprotein produced by genomic RNA segment A. To investigate the sequential changes of viral polypeptides of the virus preparation at high multiplicity infection, the viral polypeptides at each undiluted passage were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting. The results indicated that VP105 was present by undiluted passage 7, while the smaller VP2 was present by undiluted passage 10. The amount of smaller VP2 and VP105 increased as the number of passages increased.


Assista o vídeo: ESGOTO + CAIXA DE GORDURA + CAIXA SIFONADA + CAIXA DE PASSAGEM (Janeiro 2022).