Em formação

Como identificar uma bobina enrolada na sequência de aminoácidos?


Eu queria saber, quando temos uma sequência de aminoácidos, é suficiente verificar se as posições a-d correspondem a aminoácidos hidrofóbicos para dizer se ele pode formar uma estrutura em espiral? Ou precisaríamos ter certeza de que as outras posições também não são hidrofóbicas?

Todos ajudam muito apreciados.


A repetição do heptal, denotada [abcdefg]n, normalmente tem resíduos hidrofóbicos em uma e d, e resíduos polares / carregados em e e g.

Daqui.

Existe uma ferramenta de previsão com imagens úteis aqui.


A classificação da família de proteínas THAP humana identifica uma região de bobina em espiral conservada evolutivamente

A família de proteínas THAP (Thanatos Associated Proteins) em humanos está envolvida em vários processos celulares importantes, como regulação epigenética, manutenção da pluripotência, transposição e distúrbios como câncer e hemofilia. A família de proteínas THAP humana, que consiste em doze membros de comprimentos diferentes, possui um domínio de ligação ao DNA, com coordenação de zinco e terminal amino bem caracterizado, denominado domínio THAP. No entanto, o terminal carboxi da maioria das proteínas THAP ainda não foi estruturalmente caracterizado. Uma região de bobina enrolada é conhecida por ajudar na oligomerização de proteínas em THAP1 e THAP11. Não se sabe se outras proteínas THAP humanas oligomerizam. Temos usado ferramentas de bioinformática para explorar a possibilidade de dimerização de proteínas THAP por meio de uma região de bobina enrolada.

Resultados

A classificação da proteína THAP humana em três grupos baseados em tamanho levou à identificação de uma região alfa helicoidal evolutivamente conservada, a jusante do domínio THAP do terminal amino. As previsões de estrutura secundária, gráficos de roda helicoidal alfa e modelos de proteínas demonstraram a forte possibilidade de formação de bobinas enroladas nesta região conservada rica em leucina de todas as proteínas THAP, exceto THAP10.

Conclusões

A identificação de uma região de oligomerização prevista na família de proteínas THAP humana abre novas direções para investigar os membros desta família de proteínas.


Fundo

Técnicas experimentais de alto rendimento começaram recentemente a descobrir as interações proteína-proteína na escala proteômica [1-6]. Conforme o número de organismos totalmente sequenciados cresce, no entanto, torna-se cada vez mais necessário desenvolver métodos computacionais para prever essas interações. A dificuldade de prever computacionalmente as estruturas das proteínas sugere uma estratégia de concentração primeiro nas interações mediadas por interfaces específicas de geometria conhecida.

Neste artigo, nos concentramos em uma interface de interação de proteína comum e bem caracterizada - a bobina em espiral de duas fitas paralela. Coiled coils são encontradas em proteínas que participam de diversos processos, incluindo transcrição, oncogênese e fusão de membrana, prevendo que as interações proteína-proteína mediadas por este motivo terão importantes ramificações biológicas. As bobinas em espiral consistem em duas ou mais hélices α que se enrolam uma em torno da outra com uma ligeira torção superélica para a esquerda. Uma repetição característica do heptal (ABCDEFG)n define o posicionamento dos resíduos em cada hélice em relação à interface de interação (Figura 1). As posições enterradas uma e d geralmente contêm aminoácidos hidrofóbicos e as posições mais expostas g e e freqüentemente contêm aminoácidos carregados e polares. Esta estrutura simples e periodicidade permitem o reconhecimento de potenciais sequências de bobinas por meio de métodos estatísticos (por exemplo, [7–12]), bem como previsões detalhadas da estrutura e energética de suas interfaces hidrofóbicas por meio de modelagem molecular [13–15].

Desenho de uma bobina de dois fios paralela. (uma) Vista lateral e (b) vista do topo. A interface entre as hélices α em uma estrutura em espiral é formada por resíduos nas posições centrais uma, d, e e g. As posições nas duas hélices são distinguidas pela notação primária, por exemplo, uma e uma' são posições análogas nas duas hélices. N, terminal amino C, terminal carboxi.

Muito do que se sabe sobre a estrutura e especificidade de bobinas em espiral de duas fitas paralelas foi verificado por meio de estudos biofísicos de peptídeos derivados de fatores de transcrição bZIP (por exemplo, [16-22]). As regiões coiled-coil dessas proteínas também são conhecidas como zíperes de leucina porque o núcleo d as posições são dominadas por resíduos de leucina. Os bZIPs homo e heterodimerizam uns com os outros por meio de suas regiões de bobina enrolada. Apesar da homologia de sequência prontamente aparente, eles exibem um alto grau de seletividade de parceria que os permite funcionar em diversas vias. Recentemente, a tecnologia de array de proteínas foi usada para determinar as interações coiled-coil dentro de um conjunto quase completo de fatores de transcrição bZIP humanos [23]. As interações descobertas mostraram alta reprodutibilidade e excelente consistência com estudos publicados anteriormente, dando-nos alta confiança nos dados.

Neste trabalho, aplicamos um método para prever as interações coiled-coil [24] para as proteínas bZIP humanas. Os dados do array fornecem uma excelente oportunidade para testar nosso método e avaliar sua utilidade para o problema geral de predição de bobina enrolada. Nosso método representa bobinas em termos de suas interações interélicas e deriva, de um conjunto de dados base de sequência e dados experimentais, um 'peso' que indica o quão favorável é cada interação resíduo-resíduo. Nosso método é capaz de prever parceiros de interação com alta confiança, identificando uma fração significativa (70%) de pares de bZIP fortes, mantendo que a maioria (92%) das interações previstas estão corretas. Outros testes de validação cruzada demonstram até que ponto os dados de bZIP humanos refinam nosso método e sugere níveis de confiança, com base na similaridade de sequência compartilhada, para prever interações de bZIP em novos genomas.

Antes deste trabalho, houve apenas um sucesso modesto em prever a especificidade de parceria de proteínas em espiral de ocorrência natural. Uma versão anterior do nosso método foi testada em bobinas de fibras fibrosas. Ele foi capaz de eliminar uma grande fração de parceiros não interagentes para uma determinada sequência de bobina, mas não encontrou o parceiro real [24]. Vários outros grupos contaram o número de interações eletrostáticas favoráveis ​​e desfavoráveis ​​para fazer algumas previsões específicas sobre a natureza de determinadas interações bobinas [18, 25, 26]. Recentemente, regras simples incorporando ambos ge ' eletrostática e aa ' interações polares têm sido usadas para avaliar a dimerização potencial de bZIP no Drosófila genoma [27], mas até agora a maioria dessas previsões não foram corroboradas experimentalmente. Em dados bZIP humanos, essas regras simples são capazes de identificar apenas uma pequena fração das interações fortes conhecidas em um alto nível de precisão. Por exemplo, quando são definidos de modo a identificar pelo menos um terço das interações fortes, dão origem a tantos falsos positivos (FP) quanto verdadeiros positivos (TP).

Abordagens genômicas inteiras e cruzadas para prever proteínas parceiras tiveram algum sucesso [28-34]. Nosso trabalho, no entanto, é o primeiro a demonstrar previsões computacionais em grande escala e de alta confiança para qualquer motivo de interação de proteínas.


Predição de domínio de proteína

Os domínios de proteína são arranjos de elementos de estrutura secundária, que conferem uma função biológica. As proteínas complexas evoluíram por uma montagem mix-and-match de domínios individuais ou pela concatenação de várias unidades do mesmo domínio. Os domínios têm uma função semelhante em diferentes organismos e a organização dos domínios da proteína leva a dicas sobre a função da proteína. Um dos motivos mais difundidos é uma “hélice-volta-hélice”, que sugere que sua proteína é capaz de se ligar ao DNA de alguma forma.

Exemplos de programas que prevêem domínios específicos:

Bancada de trabalho de análise de sequência de proteína PSIPRED & # 8211, incluindo estrutura secundária e previsão de proteína desordenada

Segmentos helicoidais transmembrana de Phobius & # 8211 e sequências de sinal

COILS & # 8211 previsão de regiões coiled-coil, características para proteínas estruturais ou proteínas envolvidas na regulação da transcrição


Projeções de roda helicoidal para proteínas

Uma roda helicoidal é um tipo de gráfico ou representação visual usado para ilustrar as propriedades das hélices alfa nas proteínas. A sequência de aminoácidos que compõe uma região helicoidal da estrutura secundária da proteína & # x27s são plotados em uma maneira rotativa onde o ângulo de rotação entre aminoácidos consecutivos é 100 °, de modo que a representação final olhe para baixo do eixo helicoidal. O gráfico revela se os aminoácidos hidrofóbicos estão concentrados em um lado da hélice, geralmente com aminoácidos polares ou hidrofílicos do outro. Este arranjo é comum em hélices alfa dentro de proteínas globulares, onde uma face da hélice é orientada em direção ao núcleo hidrofóbico e uma face é orientada em direção à superfície exposta ao solvente. Padrões específicos característicos de dobras de proteínas e motivos de docking de proteínas também são revelados, como na identificação de regiões de dimerização de zíper de leucina e bobinas enroladas. Este diagrama de projeção é freqüentemente chamado de & quotEdmondson wheel & quot em homenagem ao seu inventor.

O que diz seu inventor?

Edumudosn mencionado em seu artigo clássico

Como ler uma roda helicoidal

A partir do entendimento básico das estruturas helicoidais alfa determinadas por Corey, Pauling e Ramachandran, sabemos que uma volta helicoidal completa (o que significa rotação de 360 ​​graus) é obtida dentro de um intervalo de 3,6 resíduos (e esta é a razão pela qual a hélice alfa também é chamada de 3,613 hélice). Agora imagine olhar uma hélice alfa de cima. Qualquer hélice do topo pareceria uma roda. Mas, para determinar uma sequência, é preciso observar os ângulos em que os aminoácidos subsequentes serão observados. Portanto, com base nas informações acima, podemos dizer que uma nova adição de aminoácido a um peptídeo na hélice alfa ocorrerá a 100 graus (360 graus dividido por 3,6). Também deve-se lembrar que no caso da hélice alfa destra, a leitura será feita no sentido horário, enquanto que na hélice alfa canhota a leitura será feita no sentido anti-horário.

Exemplo de roda helicoidal

A figura a seguir descreve uma projeção de roda helicoidal simples, para o peptídeo helicoidal alfa com a sequência ADITYAARYA, você pode notar que esta hélice é uma hélice destra, portanto, é necessário começar a partir dos aminoácidos marcados como A1 e, em seguida, mover no sentido horário para obter a sequência completa. Se fosse uma hélice canhota (ou hélice composta de D-aminoácidos em vez de L-aminoácidos), nós a leríamos no sentido anti-horário.


& ltp> Esta seção fornece informações sobre a expressão de um gene no nível de mRNA ou proteína em células ou em tecidos de organismos multicelulares. & ltp> & lta href = '/ help / expression_section' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Expressão i

Bancos de dados de expressão gênica

Bgee dataBase for Gene Expression Evolution

ExpressionAtlas, Diferencial e Expressão de Linha de Base

Portal de pesquisa genevisível para dados de expressão normalizados e com curadoria do Genevestigator

Bancos de dados específicos de organismos


& ltp> Esta seção exibe, por padrão, a sequência canônica da proteína e, mediante solicitação, todas as isoformas descritas na entrada. Também inclui informações pertinentes à (s) sequência (s), incluindo & lta href = "http://www.uniprot.org/help/sequence%5Flength"> comprimento & lt / a> e & lta href = "http: //www.uniprot .org / help / sequence "> peso molecular & lt / a>. As informações estão arquivadas em diferentes subseções. As subseções atuais e seu conteúdo estão listados abaixo: & ltp> & lta href = '/ help / responses_section' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Sequência s (2+) i

& ltp> Esta subseção da seção & lta href = "http://www.uniprot.org/help/sequences%5Fsection"> Sequência & lt / a> indica se a & lta href = "http://www.uniprot.org/help / canonical% 5Fand% 5Fisoforms "> sequência canônica & lt / a> exibida por padrão na entrada está completa ou não. & ltp> & lta href = '/ help / sequence_status' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Status da sequência i: Concluída.

Esta entrada descreve 2 & ltp> Esta subseção da seção 'Sequência' lista as sequências de proteínas alternativas (isoformas) que podem ser geradas a partir do mesmo gene por um único ou pela combinação de até quatro eventos biológicos (uso de promotor alternativo, splicing alternativo, iniciação alternativa e framehifting ribossomal). Além disso, esta seção fornece informações relevantes sobre cada isoforma de proteína alternativa. & Ltp> & lta href = '/ help / alternative_products' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> isoformas produzidas por emenda alternativa . AlignAdd à cesta Adicionada à cesta

Esta entrada tem 2 isoformas descritas e 1 isoforma potencial que é mapeada computacionalmente. Mostrar allAlign All

Esta isoforma foi escolhida como & ltdiv> & ltp> & ltb> O que é a sequência canônica? & Lt / b> & ltp> & lta href = '/ help / canonical_and_isoforms' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> sequência canônica i. Todas as informações de posição nesta entrada se referem a ele. Essa também é a sequência que aparece nas versões para download da entrada.

A sequência desta isoforma difere da sequência canônica da seguinte forma:
225-273: VQHKRYDAIL. ELRKCIGMQE → GLAPSPRLEC. IFSRDGVSPC

& ltp> Em proteomas de referência de eucariotos, as entradas não revisadas que provavelmente pertencem ao mesmo gene são mapeadas computacionalmente, com base em identificadores de genes de Ensembl, EnsemblGenomes e bancos de dados de organismo modelo. & ltp> & lta href = '/ help / gene_centric_isoform_mapping' target = '_ top '> Mais. & lt / a> & lt / p> Sequências de isoformas potenciais mapeadas computacionalmente i

Pontuação de anotação: 1 de 5

Variante natural

Chave de recursoCargosDescrição Ações Vista gráficaComprimento
& ltp> Esta subseção da seção 'Sequência' descreve as variantes naturais da sequência da proteína. & ltp> & lta href = '/ help / variant' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Variante natural i VAR_061579 269I → T. Corresponde à variante dbSNP: rs9567280 Ensembl. 1

Sequência alternativa

Chave de recursoCargosDescrição Ações Vista gráficaComprimento
& ltp> Esta subseção da seção 'Sequência' descreve a sequência de isoformas de proteínas alternativas que ocorrem naturalmente. As mudanças na sequência de aminoácidos podem ser devido a splicing alternativo, uso de promotor alternativo, iniciação alternativa ou deslocamento de quadro ribossomal. & Ltp> & lta href = '/ help / var_seq' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Sequência alternativa i VSP_025114 225 – 273VQHKR… IGMQE → GLAPSPRLECSSAISAHCKL CLPGSRHSPASASGVAGTTG ACHHTQLIFCIFSRDGVSPC na isoforma 2. 2 Publicações

& # xd & ltp> Informações selecionadas manualmente com base em declarações em artigos científicos para os quais não há suporte experimental. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / evidences # ECO: 0000303"> Mais. & lt / a> & lt / p> & # xd Asserção manual com base na opinião em i


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Resultados

A Família LRIM

A superfamília LRR é composta de proteínas contendo LRR com uma variedade de arquiteturas de domínio, como os receptores Toll transmembrana com seus domínios de Receptor de Interleucina Toll intracelular (TIR). Mais de 180 membros da superfamília LRR são encontrados nos proteomas previstos de cada um dos três mosquitos, conforme reconhecido por meio de suas anotações InterPro 'repetição rica em leucina' (IPR001611). A busca por genes contendo LRR com características de sequência mais semelhantes AgLRIM1 e AgAPL1C empregou uma combinação de abordagens e identificou 24 Um. gambiae, 29 Ae. aegypti, e 30 Cx. quinquefasciatus LRIM-like genes (consulte o arquivo adicional 1). Suas proteínas codificadas exibem todas ou a maioria das características-chave de Ag LRIM1 e Ag APL1C: o peptídeo sinal, os LRRs, os padrões de resíduos de cisteína e as bobinas enroladas. No entanto, nenhum gene relacionado com essas características definidoras foi identificado em qualquer um dos outros genomas de insetos representativos (mosca da fruta, abelha melífera ou piolho corporal). Os mosquitos LRIMs com todos os recursos de sequência-chave podem ser agrupados na subfamília "Long" com 10 ou mais LRRs que incluem Ag LRIM1 e Ag APL1C e os LRIMs "curtos" com apenas 6 ou 7 LRRs (Figura 1). Genes relacionados adicionais incluem os LRIMs "TM" com uma região transmembrana C-terminal prevista e os LRIMs "sem bobina" que exibem as assinaturas de sequência características, mas não possuem os domínios coiled-coil C-terminal.

As proteínas LRIM de mosquito identificadas podem ser classificadas em quatro subfamílias distintas. Os membros da família LRIM que correspondem a todas as características definidoras são classificados como LRIMs longos com 10 ou mais LRRs e LRIMs curtos com 6 ou 7 LRRs. Aqueles que exibem as características definidoras, mas que são adicionalmente previstos para conter um domínio transmembranar C-terminal são classificados como TM LRIMs, e aqueles que faltam apenas o domínio coiled-coil são denominados Coil-less LRIMs. As unidades LRR repetidas formam uma estrutura semelhante a uma ferradura, onde as fitas beta curtas formam uma folha beta paralela na face côncava do arco e as hélices ou voltas de ligação ficam na face convexa.

As características da sequência principal dos membros da família LRIM permitem que sejam feitas inferências sobre suas prováveis ​​arquiteturas estruturais, com sua característica comum de um domínio LRR de comprimento variável. As estruturas cristalinas de várias proteínas contendo LRR revelam que cada repetição consiste em uma fita beta curta e uma hélice ou volta beta, onde as fitas formam uma folha beta paralela na face interna de uma estrutura em forma de ferradura, enquanto as hélices ou voltas mentir na face externa. A determinação da estrutura do ectodomínio LRR do Receptor Tipo Toll humano 3 (TLR3) confirmou a dobra em forma de ferradura e permitiu que um modelo de interação fosse proposto onde a superfície livre de glicosilação poderia ser importante tanto para a oligomerização quanto para a ligação do ligante [18, 19]. Essas estruturas sugerem que os 6 ou 7 LRIMs contendo LRR são propensos a formar um arco raso, enquanto aqueles com mais LRRs podem se curvar em estruturas semelhantes a ferradura mais estendidas (Figura 1).

Análises de sequência comparativa do mosquito LRIM- genes semelhantes identificaram relações ortólogas e parálogas prováveis. Isso foi auxiliado pelo exame de regiões genômicas ortólogas (sintenia) entre os três mosquitos, que identificou aglomerados de LRIM ortólogos com duplicação local de genes e eventos de embaralhamento. Um aglomerado de curtas LRIMs (LRIMs 7, 8, 9, e 10) está em estreita proximidade com um gene contendo fator de troca de nucleotídeo guanina (GNEF) encontrado em todas as três espécies (Figura 2). Duplicações de LRIM8 no Um. gambiae e LRIM10 no Ae. aegypti criaram dois pares parálogos, enquanto LRIM7 e LRIM9 permaneceram como ortólogos de cópia única. A localização relativa e orientação de LRIM9 permaneceu conservado enquanto LRIM10 parece invertido em Um. gambiae. o LRIM7-LRIM8 par preservou sua orientação cabeça-cauda em todas as três espécies (com o LRIM8B parálogo em Um. gambiae), mas em Ae. aegypti foi realocado em relação ao duplicado LRIM10. A extensão genômica da região ortóloga em Ae. aegypti é cerca de quatro vezes maior, principalmente devido ao acúmulo de vários elementos repetitivos e consistente com o total

Extensão 4,6 vezes maior de regiões sintênicas em Ae. aegypti comparado com Um. gambiae [20]. Esta notável expansão genômica em Ae. aegypti também é observado no AgAPL1 cluster, que está localizado com LRIM 3, 4, e 11 ortólogos entre conservados BRACA2-like (proteína de suscetibilidade ao câncer de mama) e genes de dedo de zinco. Examinando a organização genômica de LRIM-like genes, portanto, revela eventos de duplicação de genes e embaralhamento que moldaram a evolução do LRIM família de genes em mosquitos.

Aglomerados genômicos ortólogos do mosquito Short LRIM genes. Anopheles gambiae (vermelho) cromossomo (Chr) e ortólogo Culex quinquefasciatus (roxo) e Aedes aegypti (amarelo) supercontigs (Scont) são representados com LRIM genes (verde), um fator de troca de nucleotídeo guanina (GNEF) contendo o gene (azul) e regiões de repetição (sombreado claro). As análises de sequência comparativa revelam duplicações (linhas tracejadas) de LRIM8 no Um. gambiae e de LRIM10 no Ae. aegypti, enquanto LRIM7 e LRIM9 permanecem como ortólogos de uma única cópia. Algum embaralhamento de LRIM ordens e orientações de genes ocorreram, e o acúmulo de elementos repetitivos deixou o Ae. aegypti região

Vários dos identificados LRIMGenes semelhantes foram supostamente atribuídos a papéis relacionados ao sistema imunológico a partir de estudos funcionais, sugerindo que eles também podem funcionar nas principais reações imunológicas dos mosquitos. Esses incluem AgLRIM4, um LRIM longo induzido no intestino por P. falciparum invasão de ookinete [21] AgLRIM7 e AgLRIM10, LRIMs curtos que exibem respostas transcricionais aos parasitas da malária [21] e AgLRIM8B, um terceiro gene LRIM curto que mostra padrões de transcrição responsivos ao parasita [21] e é regulado para baixo durante infecções com uma bactéria Gram-negativa [22]. The Coil-less AgLRIM17 gene também é induzido transcricionalmente no intestino do mosquito após a invasão do parasita [21] e foi inicialmente identificado no mesmo Um. gambiae pesquisa populacional que destacou o papel da AgAPL1 em resposta a Plasmodium [6]. Silenciamento de AgLRIM17 revelou que é um antagonista de ambos P. berghei e P. falciparum [21]. No Ae. aegypti, o provável LRIM1 ortólogo é regulado positivamente junto com outros genes imunes após a infecção com Wolbachia bactérias resultando em ativação imunológica e redução da expectativa de vida do mosquito [23]. Resultados de consulta de experimentos de microarray examinando Um. gambiae respostas transcricionais para infecções do parasita da malária [24] e alimentação com sangue [25] identificaram pelo menos 18 LRIMs com mudanças significativas na expressão do gene (consulte o arquivo adicional 1). Quase todos esses Um. gambiae LRIMs respondem à alimentação com sangue, enquanto LRIMs 1, 4, 6, 8A, 8B, 10 e 26 responder a P. berghei infecções. Além disso, pelo menos 12 LRIMs apresentam expressão significativamente mais elevada no corpo adiposo, o principal órgão imune dos insetos, em comparação com o intestino médio ou os tecidos do ovário. O identificado LRIMAssim, os genes semelhantes aos do mosquito formam uma família de genes do mosquito vetores de doenças que parecem ser importantes efetores na imunidade inata do mosquito.

Características da sequência de proteína LRIM

A natureza repetitiva de ambos os domínios LRR e coiled-coil, juntamente com sua tolerância a altos níveis de substituições de aminoácidos, apresentam um desafio considerável para algoritmos de alinhamento de sequência múltipla. No entanto, abordagens passo a passo com curadoria manual de alinhamentos de sequência de proteína LRIM serviram para identificar características que definem a família e ajudam a inferir prováveis ​​relações sequência-estrutura-função. Essas características de sequência tornam-se claramente discerníveis na comparação das proteínas de mosquito mais intimamente relacionadas com Ag LRIM1 e Ag APL1A / B / C (Figura 3): os LRIMs longos (LRIMs 1-4 e APL1), o LRIM sem bobina mais longo (LRIM17) e os LRIMs TM (LRIMs 15-16).

Características de sequência características da família de proteínas LRIM de mosquito. UMA. O alinhamento de sequência múltipla anotado dos LRIMs Longos (LRIM1-4), o LRIM sem bobina mais longo (LRIM17) e os LRIMs TM (LRIM15-16) de Anopheles gambiae (Ag, vermelho), Aedes aegypti (Aa, amarelo) e Culex quinquefasciatus (Cq, roxa). O alinhamento destaca as características definidoras de LRIM, incluindo o peptídeo sinal (SP), padrões de resíduos de cisteína (C-C, C-CC e C *), líder rico em leucina (LRL), repetições ricas em leucina (LRRs um) e os domínios de bobina enrolada simples e dupla (escuro, propensão & gt 90%, luz & lt 90% propensão). A região transmembranar (TM) C-terminal identifica os TM LRIMs e a repetição de aminoácidos PANGGL (Pro-Ala-Asn-Gly-Gly-Leu) é exclusiva para Ag APL1C. Os losangos pretos indicam as posições de uma sequência de frameshift no gene que codifica Ag APL1A e uma inserção de elemento transponível no gene que codifica Cq LRIM2A. B. O exame das variações de comprimento do LRR revela diferentes restrições nos comprimentos das sequências que conectam as fitas beta que formam a estrutura em forma de ferradura do LRR. As proporções dos comprimentos de LRR são mostradas para cada conjunto de LRRs alinhados definidos na Figura 3A (excluindo aqueles com apenas 3 ou 4 sequências representativas) e para aqueles calculados a partir da varredura automatizada de todos os 26 LRIMs mostrados no painel A (UMA), os proteomas completos de cada uma das três espécies de mosquitos (em), e os proteomas de quatro outros insetos (NO, Apis mellifera, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, e Tribolium castaneum). C. O padrão de conservação de resíduos de aminoácidos do LRR- invulgarmente curtog (definido no painel A) é representado no formato de logotipo de sequência. A assinatura LRR é distinguida pela asparagina conservada (N) e leucinas (eu) (ou as isoleucinas físico-quimicamente semelhantes (eu) e valinas (V)) e prolina (P) resíduos são comuns nas posições 17 e 18 de LRR-g.

LRIMs são direcionados à hemolinfa do mosquito

Ag LRIM1 e Ag Os anticorpos de peptídeo APL1C reconhecem especificamente bandas de proteína única dos tamanhos previstos em Um. gambiae extratos de hemolinfa [3], consistentes com as sequências de peptídeos sinal preditas que direcionariam essas proteínas a serem secretadas no sistema circulatório do mosquito. Curiosamente, a depleção de qualquer um dos transcritos bloqueia a secreção de ambas as proteínas dos hemócitos, indicando que a co-expressão desses dois LRIMs é necessária para a correta formação e secreção do complexo funcional LRIM1 / APL1C [3]. Além de um dos Cx. quinquefasciatus Paralogos LRIM2 (Cq LRIM2C, Figura 3A), locais de clivagem para previsões de peptídeos de sinal são encontrados para todas as proteínas LRIM (ver arquivo adicional 1). O primeiro exon contendo o peptídeo sinal de CqLRIM2C é provavelmente obscurecido por uma inserção de elemento transponível vizinho (TE) que pode tornar este gene não funcional. Da mesma forma, um

Extensão de 4,4 Kb de inserções de TE na região de codificação da bobina enrolada do CqLRIM2A parálogo (Figura 3A) pode interromper a função desta cópia, deixando CqLRIM2B como o provável ortólogo funcional APL1 / LRIM2. Os peptídeos de sinal dos LRIMs TM devem direcioná-los para a via secretora, mas suas regiões C-terminais hidrofóbicas provavelmente os ancoram na membrana celular, expondo seus ectodomínios contendo LRR de uma maneira semelhante aos TLRs. O curto,

30 aminoácidos, regiões intracelulares do TM LRIMs não têm domínios de classificação ou sinalização reconhecíveis, mas resíduos de serina e treonina conservados podem ser alvos de fosforilação potenciais. Secretados na hemolinfa do mosquito ou expostos nas membranas celulares (possivelmente hemócitos), os LRIMs podem, portanto, circular amplamente em locais onde um desafio imunológico pode desencadear uma resposta.

A repetição PANGGL é exclusiva para AgAPL1C

A região N-terminal adjacente ao peptídeo sinal do AgAPL1C gene abrange várias repetições da sequência de aminoácidos de consenso Pro-Ala-Asn-Gly-Gly-Leu, PANGGL (Figura 3A). Such repeats are not present in the other LRIM proteins and could not be identified in any other protein-coding genes. Sequencing multiple APL1C cDNA clones from laboratory adult male An. gambiae mosquitoes indicated the existence of polymorphic AgAPL1C alleles encoding variable numbers of PANGGL repeats (Figure 4). The G3 mosquitoes exhibit three major bands likely corresponding to different alleles, while up to six different alleles were identified from individuals of the more recently colonised Yaounde strain. However, the possible structural and functional significance of these PANGGL repeat polymorphisms remains to be determined.

Variation of Anopheles gambiae APL1C PANGGL (Pro-Ala-Asn-Gly-Gly-Leu) repeats in individual male mosquitoes from three laboratory strains. PCR primers amplify variable-length fragments likely corresponding to up to three, four, and six PANGGL repeat copy-number variations in samples of 12 individual G3, L35, and Yaounde mosquitoes, respectively.

LRIMs contain 6 to 14 LRRs of different lengths

The Short LRIMs and the majority of Coil-less LRIMs contain 6 or 7 recognisable LRRs while the LRR domains of the Long, TM, and remaining 3 Coil-less LRIMs are made up of 10 to 14 repeats (see additional file 1). LRR motifs are typically 20 to 30 residues in length and are characterised by an 11-residue consensus defined principally by the spacing of the leucines, LxxLxLxxNxL (Figure 3). The LRR pattern tolerates various substitutions with the leucines (eu) frequently being replaced by valine (V) or isoleucine (eu) and the position of the asparagine (N) accepting serine (S), threonine (T), or cysteine (C) replacements. LRRs of the Coil-less LRIMs show frequent N replacements while the N is ubiquitous among Long LRIM LRRs and highly-conserved among TM and Short LRIMs: T replaces N in LRR-k of the TM LRIMs (Figure 3A), and the Short LRIM5 and LRIM11 each have one LRR where N is not maintained. Apart from the LRIM1 orthologues, the LRIM LRR domains are preceded by a leucine-rich leader (LRL, Figure 3A) that resembles the LRR signature sequence but exhibits elevated leucine substitutions and almost never has the characteristic N. The similarity suggests that LRLs may form similar strand-helix/turn structures of the more canonical LRRs, but as the first of these repeating structures the LRL sequences are likely to be less constrained. The Short and Coil-less LRIMs also exhibit LRL sequences, but these are less distinct among many Coil-less LRIMs where the LRR consensus sequences are generally less well-defined. Such an irregular type of LRR-like sequence found at the start of the LRR domain is also frequently observed in the sequences of vertebrate TLRs [26]. The last LRR (LRR-n) is distinct from the other LRIM LRRs, this LRR is well-conserved with a tryptophan (C) or phenylalanine (F) consistently replacing the last 'eu' of the LRR consensus followed by a ubiquitously present cysteine residue (LxxLxLxxNx[WF]xC) This distinctive terminal LRR pattern is also observed among the Short and Coil-less LRIMs.

Examining the lengths of the LRIM LRRs revealed the exceptionally short LRR-g, which is consistently only 19 amino acids long (Figure 3B). The majority of LRIM LRRs are 24 residues in length, which is also the most common LRR length among LRR-containing proteins of mosquitoes and other insects. LRR lengths include the 11-residue consensus identifiable from sequence profiles plus the additional variable-length region before the start of the next consensus, which for LRR-g is just 8 residues long (Figure 3C). Although rare, examples of short LRRs with only 19 amino acids have been identified, e.g. Mimivirus protein R380 [27], suggesting that such short LRRs may not necessarily interrupt the complete LRR fold. Proline residues in the LRR variable regions are common in short LRRs where they form part of the convex side of these repeats. Consistent with this observation, proline is the most common residue at positions 17 and 18 of LRR-g (Figura 3C). The LRR immediately following the short LRR-g exhibits the most variable lengths with LRRs of 20, 21, 22, 23, and 24 amino acids (LRR-h) and the third 'eu' of its 11-residue LRR consensus is almost always replaced by a less bulky alanine (UMA) residue. The mosquito LRIM-like genes are thus characterised by a variable number of 6 to 14 recognisable LRRs of different lengths, with a subset of LRIMs that exhibit an unusually short LRR of only 19 amino acids.

Patterns of LRIM cysteine residues suggest critical disulphide bridging

The comparison of protein sequences most closely related to Ag LRIM1 and Ag APL1C highlights several well-conserved patterns of cysteine residues (Figure 3A). The leading C-C motif is notably absent from Ag LRIM1 and Ag APL1B, while the double-cysteine motif (C-CC) is incomplete in Aa LRIM2 and missing from the frameshift-disrupted Ag APL1A. This frameshift is present in the sequenced An. gambiae PEST genome assembly but may not occur in other populations where anti-parasitic effects of Ag APL1A have been observed [13]. The double-cysteine motif is consistently replaced by a tyrosine-cysteine motif in the TM LRIMs, and a third solitary cysteine (C*) is conserved in only LRIM1 and LRIM2/APL1 proteins. The leading C-C motif and the double-cysteine motif are also present in all Short and Coil-less LRIMs apart from the three LRIM20 orthologues that lack the leading C-C motif (see additional file 1). Such cysteine patterns are common to many LRR-containing proteins in the regions immediately flanking the LRR domain where they form intramolecular disulphide-bonded caps that stabilise the N-and C-terminal ends of the LRR domains [27]. A double-cysteine motif resembling that found in the LRIMs forms the disulphide-bonded C-terminal cap of the Nogo-66 receptor, a human LRR protein involved in signalling that modulates axon regeneration [28]. This motif contains six cysteines that form three disulphide bridges, suggesting that the LRIM C-CC motif, together with a ubiquitously conserved cysteine residue that immediately follows the last LRR consensus, could allow for the formation of two disulphide bridges to build a stabilising cap.

As well as forming the N-and C-terminal LRR caps, the patterns of cysteine residues may also be important in stabilising LRIM-LRIM interactions as in the case of Ag LRIM1 and Ag APL1C. Examining the behaviour of Ag LRIM1 and Ag APL1C using specific antibodies under non-reducing conditions revealed major protein bands of a high molecular weight complex that resolved into expected monomer sizes under reducing conditions [3]. Thus, these two LRIMs form a disulphide-bridged complex, further suggesting that the patterns of conserved cysteine residues that characterise the family of LRIM proteins may be critical to the formation of LRIM complexes. LRR-flanking cysteines have also been implicated in facilitating interactions with other proteins as in the case of mammalian TLR4 and its MD-2 (myeloid differentiation protein) partner required for the recognition of lipopolysaccharide [29]. The MD-2-like family of proteins is expanded in mosquitoes compared to the fruitfly and exhibits six conserved cysteines that may be important in such protein-protein interactions [1, 21]. At least one of these MD-2-like proteins in An. gambiae shows specificity in regulating resistance to P. falciparum [21]. Thus, cysteine residue patterns among LRIM-like proteins may be important for LRR capping as well as for stable interactions both in the formation of LRIM complexes and in the interaction with other protein partners.

LRIM coiled-coil domains may facilitate protein-protein interactions

The LRIM1 and APL1/LRIM2 proteins all exhibit a double coiled-coil C-terminal domain (Figure 3A), while the remaining Long LRIMs and all the Short LRIMs exhibit at least one coiled-coil C-terminal region (see additional file 1). Coiled-coil domains can take on a variety of conformations with different helix stoichiometries and orientations [30]. Protein coiled-coils are formed when alpha-helices wrap around each other into stable supercoiled structures of parallel or anti-parallel, homo-or hetero-, dimers or higher order oligomers found in both fibrous and globular proteins. Each of the seven-residue repeats that define the primary structure of coiled-coils gives rise to a complete turn along the alpha-helix, with an amphipathic nature required for supercoil formation. Despite understanding these principles, reliable predictions of coiled-coil domain interactions remain generally unfeasible.

While the predicted monomer sizes of An. gambiae LRIM1 and APL1C are

80 kD, respectively, the disulphide-bridged complex migrated at

260 kD suggesting the presence of a functional multimer in the hemolymph [3]. However, given that the observed size changes significantly depending on the resolving power of the gel system used for protein separation (Povelones M, unpublished data), and that coiled-coil containing proteins often exhibit aberrantly slow electrophoretic mobility, it is possible that the complex is assembled from 2-4 LRIM1 or APL1C monomers. Their double coiled-coil domains may facilitate initial associations that bring the proteins together in an orientation to promote the formation of stabilising disulphide bridges. The LRIM coiled-coil domains may therefore play critical roles in facilitating protein-protein interactions, both in the formation of LRIM protein complexes as well as in associating with other components of the mosquito complement-like system.


Protein Secondary Structure: α-Helices and β-Sheets

In the following we will focus on the general aspects of protein secondary structure. Many of the features discussed here are essential for practical applications &minus for example in sequence alignment and analysis, homology modelling and analysis of model quality, in planning mutations or when analyzing protein-ligand interactions.

The &alpha-helix
The most common type of secondary structure in proteins is the &alpha-helix. Linus Pauling was the first to predict the existence of &alpha-helices. The prediction was confirmed when the first three-dimensional structure of a protein, myoglobin (by Max Perutz and John Kendrew) was determined by X-ray crystallography. An example of an &alpha-helix is shown on the image below. This type of representation of a protein structure is called &ldquosticks representation&rdquo. To get a better impression of how a helix looks like, only the main chain of the polypeptide is shown, no side chains. There are 3.6 residues/turn in an &alpha-helix, which means that there is one residue every 100 degrees of rotation (360/3.6). Each residue is translated 1.5 Å along the helix axis, which gives a vertical distance of 5.4 Å between structurally equivalent atoms in a turn (pitch of a turn). The repeating structural pattern in helices is a result of repeating (similar) &phi and &psi values, which is reflected in the clustering of the torsion angles within the helical region of the Ramachandran plot . When looking at the helix in the figure below, notice how the carbonyl (C=O) oxygen atoms (shown in red) point in one direction, towards the amide NH groups 4 residues away (i, i+4). Together these groups form a hydrogen bond, one of the main forces in the stabilization of secondary structure in proteins. The hydrogen bonds are shown on the figure as dashed lines.

The &alpha-helix is not the only helical structure in proteins. Other helical structures include the 3_10 helix, which is stabilized by hydrogen bonds of the type (i, i+3) and the &pi-helix, which is stabilized by hydrogen bonds of the type (i, i+5). The 3_10 helix has a smaller radius, compared to the &alpha-helix, while the &pi-helix has a larger radius. The first detailed analysis of the occurrence of the &pi-helix in proteins, based on the analysis of entries in the Protein Data Bank (PDB), was published by Fodje & Al-Karadaghi, 2002 .
We should also note that in addition to the &ldquosimple&rdquo helical structures mentioned here, there is a number of so-called coiled-coil structures, in which two or more &alpha-helices together build higher-order helical structures.

The &beta-sheet
The second major secondary structure element in proteins is the &beta-sheet. &beta-sheets consist of several &beta-strands, stretched segments of the polypeptide chain kept together by a network of hydrogen bonds between adjacent strands. An example of a &beta-sheet, with the stabilizing hydrogen bonds between adjacent strands (shown as dotted lines), is shown in the image below:

It is important to note that unlike in helices, the residues informing hydrogen bonds between the adjacent strands are separated from each other by long segments of the amino acid sequence.

In the following image the same &beta-sheet is shown, this time in the context of the 3D structure to which it belongs and in a so-called "ribbon" representation (the coloring here is according to secondary structure - &beta-sheets in yellow and helices in magenta). Each &beta&minusstrand is represented by an arrow, which defines its direction starting from the N- to the C-terminus. When the strand arrows point in the same direction, we call such &beta-sheet parallel (the protein PDB code is 1G8P, BchI subunit of magnesium chelatase). You may also notice a &beta-hairpin, two strands connected by a loop in the left corner of the image:

In the image below you can see that the strand arrows point in opposite directions, which is a characteristic of an anti-parallel &beta-sheet (this protein PDB code is 1USR, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase).

Loops, turns and hairpins
When there are only 2 anti-parallel &beta-strands, like in the figure below, it is called a &beta-hairpin.

The loop between the two strands is called a &beta-turn. Short turns and longer loops play an important role in protein 3D structures, connecting together strands to strands, strands to &alpha-helices, or helices to helices. The amino acid sequences in loop regions are often highly variable within a protein family. But in some cases, when a loop has some specific function, for example interaction with another protein, the sequence may be conserved. Loop length in proteins from organisms living at elevated temperatures (thermophilic organisms) is usually shorter than in protein from lower-temperature family members, presumably to give a protein additional stability at high temperatures, preventing its unfolding and denaturation. During sequence alignment and homology modeling , when it is essential to have an accurate sequence alignment, the highly variable length of loop regions justifies the localization of insertions and deletions in the amino acid sequence to loop regions.

Structural motifs that contain combinations of helices, helices and strands, etc., are closely linked to protein fold. For this reason, when viewing a protein 3D structures, it is an advantage to be able to recognize the secondary structure elements and to identify structural motifs. In the next section we will examine some of the ways by which secondary structure elements connect to each other, forming common structural motifs and folds .


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